PCR (polimerāzes ķēdes reakcijas) eksperimentos iesaiņojums var šķist vienkāršs, taču tas tieši ietekmē reaģenta stabilitāti, lietošanas vienkāršību un ticamus rezultātus. Neatkarīgi no tā, vai laboratorijas glabāšana un transportēšana - sagatavoja reaģentus vai komerciālus priekšlaicīgus priekšvakarus, pareizu PCR iepakojuma metožu apgūšana var izvairīties no izplatītām kļūdām un uzlabot eksperimentālo efektivitāti. Zemāk mēs dalāmies ar praktiskiem padomiem par materiālu izvēli, iesaiņošanas stratēģijām un glabāšanas informāciju.
I. Iepakojuma materiāla izvēle: Savietojamības un aizsardzības prioritāšu noteikšana
PCR reakcijas ir jutīgas pret temperatūru, gaismu un piesārņotājiem, tāpēc iesaiņojuma materiāliem jāatbilst trim galvenajām prasībām: hermētiskumam, gaismai - pierādījums un ķīmiskā inerce.
Centrifūgas caurulēm un PCR plāksnēm priekšroka tiek dota polipropilēnam (PP), ņemot vērā tā augsto caurspīdīgumu un DNase/RNase - Bezmaksas īpašības {. 0.2 ml plānas - sienas pCR caurules ir ideāli piemērotas, lai ātras karstuma pārnešana būtu ideāla. 96 - labi PCR plāksnēm mēs iesakām izvēlēties svītru dizainu (robotu manipulācijas ērtībai) vai nesmērētu dizainu (kosmosa saglabāšanai).
Blīvēšanas metode: parastās centrifūgas caurules izmanto plakanus vai paceltus vāciņus (lai novērstu iztvaikošanu un izžūšanu). Tomēr ilgai - Termiņa glabāšanai, lai līdzsvarotu iekšējo un ārējo spiedienu, ir ieteicama siltums - plēves blīvēšanas (piemēram, parafilm) vai elpojoša plēve (piemēram, aeraseal). PCR plāksnes ieteicams izmantot līmes alumīnija folijas blīvētājus (augstus {- izturīgu temperatūru) vai sevis - adhēzijas plēvi (vienai - lietošanai).
Gaismas aizsardzība: reaģenti, kas satur gaismu - jutīgas sastāvdaļas (piemēram, noteiktas krāsvielas vai gruntējumus), jāapto alumīnija folijā vai jāizmanto melnas PCR plāksnes (pieejamas no dažiem ražotājiem).
II. Alikvotēšanas paņēmieni: samazinot zaudējumus no atkārtotiem iesaldēšanas - atkausēšanas cikliem
Alikvotie reaģenti ir galvenais solis PCR iesaiņojumā un tieši ietekmē eksperimentālo reproducējamību.
Master Mix alikvēšana: Komerciālo galveno maisījumu (piemēram, Taq enzīmu un DNTP maisījumu) ieteicams alikvotēt, pamatojoties uz reakcijas tilpumu, kā arī 5% - 10% malu (piemēram, 20 μl reakcijai, alikvot 22 μl uz mēģeni). Izvairieties lietot tieši no lielapjoma iepakojuma, jo atkārtots iesaldēšana - atkausēšanas cikli var izraisīt samazinātu enzīma aktivitāti (TAQ enzīms var zaudēt aptuveni 5% aktivitātes vienā sasalšanas un atkausēšanas ciklā).
Grunts un veidnes: gruntējumus (īpaši pielāgotus gruntējumus) ieteicams alikorēt no 100 μm krājuma risinājumiem un saglabāt - 20 grādu. Pirms lietošanas atšķaida līdz darbojošai koncentrācijai (parasti 0,1–1 μm). Veidnes, piemēram, genoma DNS, jābūt alikvotām atsevišķā - daudzumos, lai izvairītos no savstarpējas piesārņojuma.
Padomi par piesārņojuma profilaksi: pirms alikvotēšanas pārliecinieties, ka centrifūgas caurules ir sausas (atlikušais etanols var kavēt PCR), pirms - atdzesē pipetes padomus, lai neļautu aukstiem reaģentiem pielipt pie sienas, un valkāt cimdus visā procesā, lai izvairītos no ādas DNS piesārņojuma.
III. Marķēšana un lietvedība: Izvairieties no slazda "melnās kastes"
Skaidra marķēšana ir būtiska PCR iepakojumam; Nepareizs marķējums var sabojāt visu eksperimentu.
Obligāta marķēšanas informācija: reaģenta nosaukums (piemēram, "2 × Taq MasterMix"), koncentrācija/saturs (piemēram, "10 mm DNTPS"), partijas numurs (izsekojamībai), uzglabāšanas apstākļi (piemēram, "-20 grādi aizsargāti no gaismas"), alikvotu datums un derīguma termiņš (EG, "lietošana 6 mēnešu laikā").
Īpašais marķējums: ja reaģentā ir glicerīns (antifrīzs), krāsvielas (piemēram, SYBR zaļā) vai piedevas (piemēram, BSA), jāsniedz papildu informācija (piemēram, "satur 50% glicerīna, neuzglabā augstā temperatūrā").
Ierakstu sinhronizācija: ieteicams izmantot izklājlapu vai laboratorijas pārvaldības programmatūru (piemēram, Labguru), lai reģistrētu katras caurules satura detalizētus parametrus (piemēram, gruntēšanas secība, TM vērtība) un saistīt tos ar fiziskās etiķetes numuru.
Iv. Uzglabāšana un transports: temperatūras un fiziskās aizsardzības līdzsvarošana
PCR reaģentu stabilitāte ir ļoti atkarīga no uzglabāšanas apstākļiem, un pārvadāšanas laikā nepieciešama papildu aizsardzība.
Vispārējā glabāšana:
Fermenti (Taq, reversā transkriptāze): gara - Termiņa krātuve pie - 20 grāda (izvairieties no atkārtotiem sasaldēšanas un atkausēšanas cikliem; alikvots un uzglabāt -80 grādos turpmākai lietošanai);
Grunts/zondes: uzglabāt -20 grādu vairāk nekā 1 gadu (ja tajā ir modificēta grupa, piemēram, biotīns, aizsargājiet no gaismas);
Non - enzīmu buferi (piemēram, PBS): īss - Termiņa krātuve ar 4 grādiem (līdz 1 mēnesim).
Transporta prasības:
Aukstas ķēdes pārvadāšanai fermentiem (-} 78 grādi) izmantojiet sausu ledu (uzturēts zem -20 grādiem) un zilais ledus (apmēram 0 grādi) buferiem īstermiņa pārvadāšanai.
Izvairieties no pārmērīgas vibrācijas (PCR plāksnes jābūt nostiprinātām putu kastēs, lai novērstu reaģentu sajaukšanu starp akām).
Augstas vasaras temperatūras laikā iepakojumam pievienojiet izolācijas slāni (piemēram, alumīnija folijas izolācijas maiss + saldēta želejas iepakojums).
V. Kopīgas problēmas un risinājumi
1. problēma: reaģenta nokrišņi (piemēram, DNTPS vai MGCL₂ nokrišņi zemā temperatūrā) → Risinājums: īsi centrifūga (1000 apgr./min., 1 minūte) pirms alikvošanas. Pirms lietošanas izšķīst 37 grādu inkubatorā un virpuļo, lai to kārtīgi sajauktu.
2. problēma: plāksnes blīvētājs viegli nofiksē → Risinājums: izvēlieties Heat - izturīgs blīvētājs ar līmes pamatni vai izmantojiet siltuma blīvētāju (piemērots augstiem - caurlaides eksperimentiem).
3. problēma: izplūdušas etiķetes → Risinājums: izmantojiet ūdensnecaurlaidīgu marķieri (piemēram, Sharpie) vai lāzeru - drukas etiķetes, lai neļautu rokrakstam izdzēst alkoholu.
Secinājums
PCR iepakojums ir kas vairāk nekā tikai "iesaiņojuma" reaģenti; Tā ir pirmā aizsardzības līnija eksperimentālai uzticamībai. Izvēloties atbilstošus materiālus, standartizējot alikvošanas procesu, uzturot rūpīgu marķēšanu un saglabājot stingru temperatūras kontroli pārvadāšanas laikā, jūs varat ievērojami samazināt cilvēku kļūdas, nodrošinot stabilākas turpmākas pastiprināšanas reakcijas un ticamākus rezultātus. Atcerieties: detaļas nosaka panākumus. Pareiza PCR iepakojuma prakse var ietaupīt ievērojamu laika problēmu novēršanu visā jūsu eksperimenta laikā!